近年来测序很火，很多实验室正在或已经完成了sRNA的测序工作，miRNA研究越来越火，然而，找公司设计引物合成引物真心贵（对于我们穷屌丝来说……）。本人自己动手琢磨了会，哎哟喂~效果良好！
好了不闲扯了，下面给大家分享一下我的方法。
miRNA引物设计（茎环法）原理：由于miRNA在20bp左右，没法根据其设计引物检测出来，于是，人们就先将其延长，也就是先加一个环状片段，这样就使得原来20bp左右的延伸为80bp左右了，然后就可以根据这个80bp片段设计引物啦。
具体操作：
需要三种引物：逆转录引物（RT-primer，用于延长miRNA的）、实时定量PCR上游引物、实时定量PCR通用下游引物。
1、逆转录引物
逆转录引物序列由5’端茎环结构引物和3’端miRNA特异性序列组成。“特异的反向引物约42-44个核苷酸，其5’端的36个核苷酸序列是固定的，形成一个8核苷酸环和20核苷酸茎的结构，其3’端的6-8个核苷酸就与microRNA互补。”5’端茎环结构通常固定，如5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’ ；3’端特异性序列由与成熟的miRNA 3’端若干寡核苷酸反向互补配对所得。
即：逆转录引物为“5‘- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGNNNNNNNN-3’（N 为miRNA3’端反向互补的6-8个碱基）。
通俗地说就是，固定的颈环序列（网上很多或者用我这个也行）+miRNA末端6-8个反向互补碱基。
以 mmu-[size=14.6666669845581px]miR-16-5p ([size=13.3333330154419px]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG) 颈环序列+末尾 8个碱基反向互补。即为 ：
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGcgccaata
[size=13.3333330154419px]
2、实时定量PCR上游引物
上游引物包括5’端通用序列和3‘端miRNA特异序列，5’端通用序列为：5’-GCCGAG-3’或5’-TCGGCAGG-3’，用于延伸实时定量PCR产物的长度；3’端为跟据成熟miRNA自身碱基组成及GC含量适当删减几个碱基所得的寡核苷酸或完整的成熟miRNA。
即：上游引物为5‘- 通用引物+NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’ ，自miRNA5’端抄起，14-16个或13-14个。
通俗的说就是：保护性碱基（用来调GC含量的）+miRNA 5 端的13-16个碱基（不要抄到最后那6-8个上去了，意思就是不要与RT那段重叠了）
3、实时定量PCR通用下游引物
下游通用引物：5’- CTCAACTGGTGTCGTGGA -3’ （茎环引物上取，可以挪）这个就更简单了，直接在颈环上摞一段即可，然后计算下gc完事。
嗯的，如果你有土豪boss罩着，可以忽略本文，找生物公司做引物设计。
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