脆弱类杆菌介绍,1983年发现的革兰阴性短杆菌

脆弱类杆菌（Bacterooides fragilis，Bf）为革兰阴性短杆菌有荚膜，无芽胞，部分有菌毛，专性厌氧，近年来发现产肠毒素脆弱类杆菌（Enterotoxigenic Bacteroides fragilis，ETBF）能够引起家畜、儿童和成人腹泻，资料表明腹泻患者ETBF分离率达9。2%~26。8%，从而引起了研究人员的重视，并对其致病物质—脆弱类杆菌毒素（Bacteroides fragilis toxin，BFT）和生物学特性，编码基因、致病机理、及检验方法等进行了深入研究。

脆弱类杆菌发现史

1983年Myers等在调查羊羔流行性腹泻的过程中发现，腹泻羊羔的粪便可以刺激正常羊羔结扎肠段的分泌反映，经过一系列的实验，最后确定该分泌反应是由Bf分泌一种能够刺激羊羔结扎肠段分泌反应的毒素引起，命名为Bf毒素（BFT）。依据能否合成、分泌BFT可将Bf分为产肠毒素脆弱类杆菌（ETBF）和非产肠毒素脆弱类杆菌（Nontoxigenic Bacteroids fragills，NTBF）。

脆弱类杆菌合成和分类

合成与分泌

BFT为一种类似于真核生物胶原酶的细胞外锌-金属蛋白酶（Zinc-metalloproteinase），分子量约（20000），不耐热，具有蛋白水解活性。ETBF首先合成一个分子量约为（44 000）的BFT前体物质，前体物质包含三个连续的多肽片段，即前信号肽序列，由18个氨基酸残基组成，为典型的脂蛋白；193个氨基酸残基构成的多肽原以及186个氨基酸残基构成的成熟蛋白质（BFT）。成熟蛋白质从前体物质解离后，被分泌到培养上清液中，多肽原可能与BFT的释放有关。Rokosz等报道亚抑制浓度（MIC浓度以下）的克林霉素可延缓和减少BFT的合成和释放。

异构体

当今已发现3种BFT异构体，即BFT-1，BFT-2和BFT-3。BFT-1、BFT-2分别由ETBF VPI 13784、86-5443-2-2菌株合成、分泌。BFT-3（Korea-BFT）由Chung和Kato分别于1999年、2000年从韩国和日本分离的ETBF菌株中发现，BFT-1和BFT-2具有92%的相同氨基酸序列，主要差异为：（1）用高辨析率阴离子交换柱纯化BFT时，洗涤时所用的NaCl溶液浓度不同，表明两者所带的净电荷量不同；（2）体外实验表明，F、BFT-2对HT29/C1细胞系的生物活性化BFT-1微弱而持久；（3）二者在SDS-PAGE时表现出不同的电泳特性；（4）二者的抗原性也存在一定的差异。BFT-3与BFT-1、BFT-2分别有21和11个氨基酸的差异，氨基酸序列分析表明BFT-3与BFT-2关系更加密切，主要表现为用高辨析率阴离子交换柱纯化BFT时洗涤所用的NaCl溶液和SDS-PAGE时电泳特性相同，但BFT-2缺乏存在于BFT-3C末端的具有疏水，亲水两重性的区域现已有人报道从欧洲分离的ETBF检测到BFT-3，但检出率显著低于亚洲地区，提示BFT具有一定的地区特异性。

BFT编码基因

BFT编码基因（bft）位于细菌染色体上一个长约6kb的致病岛小于常规致病岛，只包含bft和编码另一种金属蛋白酶的基因，称作为mp II，缺乏编码将毒素运送支靶细胞的分泌系统的基因。部分ETBF可存在双拷贝致病岛基因。Bft有3种等位基因。即bft-1，bft-2和bft-3，分别编码BFT-1、BFT-2和BFT-3。Bft-1，bft-2碱基序列相符率为93%，bft-3与bft-1，bft-2具有高度同源性，枋苷酸序列相符率为89%~94%，与bft-2关系更加密切。1999年Franco等发现除致病岛外，ETBF还具有一个长度为3kb的致病岛侧翼区（flanking region）。通过将致病岛克隆到II型NTBF（不含致病岛及侧翼区）和III型NTBF（不含致病岛但含有侧翼区）后观察ETBF合成能力的研究发现，致病岛和其上游的700bpDNA片段对BFT合成和分泌具有重要的作用。2000年Grosso等利用限制性片段长度多态性分析、基因测序及等位基因特异性PCR等技术检测66例来自不同类型酝酿的ETBF产肠毒素基因，结果显示bft-1是最常见的等位基因。约占分离ETBF菌株的65%，在来自成人粪便的ETBF菌株中更常见，而bft-2主要存在儿童粪便的ETBF菌株。该研究还发现携带bft-1或bft-2基因的ETBF产生的具有生物活性的毒素最远多于携带bft-3基因的ETBF。

脆弱类杆菌致病性及机制

致病性

除引起羊羔腹泻疾病外ETBF亦可使牛渎、马驹和小猪等家畜致病。1987年Myers首先报道从诊断不明确的的散发性儿童和成人腹泻患者的粪便中分离出ETBF，随后发现从1岁以下的婴儿粪便中分离出的ETBF与腹泻无明显关系，但ETBF与1至5岁的幼儿腹泻疾病关系密切。Durmaz 报道BFT可触发原癌基因表达而与结肠癌的发病相关。

机制

一般认为BFT改变微纤维肌动蛋白的结构，并裂解粘着小带蛋白，即E-钙粘素，导致肠上皮细胞间紧密连接的破坏从而增加肠道通透性。Francea等经体外单层人类肠上皮细胞（T84）实验表明，当BFT作用于T84细胞基底外侧时，可出现短暂的、BFT浓度依赖性的Lsc电流（短回路电流）增强，提示C1-分泌增加。Sanfilippo等报道BFT可刺激结肠肠上皮细胞分泌IL-8，转化生长因子-β（TGF-β）。肠上皮细胞分泌IL-8和TGF-β的能力在一定程度上决定了肠黏膜损伤程度和预后。

BFT检测方法

最初用于BFT检测的方法是动物接种法，但动物对BFT的敏感性存在很大差别，而且动物接种法特异性较差，现已淘汰。

1992年以来，利用BFT能改变人类结肠癌衍生的连续肠上皮细胞系，HT-29/C1细胞（克隆的HT-29细胞）经BFT作用3h后出现圆形变，并且细胞簇散裂，敏感性、特异性分别达到89%和100%，纯化BFT灵感度达0。1ng/ml。该方法的主要缺点为HT-29/C1细胞形态改变缺乏客观评判标准，容易受实验人员主观因素的影响；HT-29/C1细胞的培养和厌氧菌的分离鉴定需要复杂的实验条件和较高的技术要求并且费时。

PCR以BFT为检测目标，1997年Pantosti等采用HT-29/C1细胞培养和PCR同时检测113株来自培养物和粪便标本的BFT，结果表明两者的实验结果完全吻合，并且PCR的灵敏达105~104CFU/g粪便标本。Kato等用HT-29/C1细胞培养和PCR方法检测188株从肠道外标本分离的Bf，结果发现35株Bf两种方法均为阳性，而细胞培养法阴性，两者的相符率达99%以上。Shetab等报道套用式PCR可将灵敏度进一步提高到103~102CFU/g粪便标本。由于粪便中存在的抑制物可降低PCR的敏感性。为了排除PCR抑制物的干扰，Weintraub等采用特异性单抗包被的磁球捕获、分离细胞与PCR相结合的IMS-PCR方法直接检测粪便是的ETBF，将灵敏度提高至0~50CPU/g粪便标本。PCR方法存在的主要问题：粪便及其他肠外标本均含有PCR抑制物，易导致PCR敏感性降低，造成假阴性结果；PCR以bft为检测目标，如果存在基因不表达或死亡细菌残骸，则易导致假阴性；PCR 方法费用较高。

此外，单克隆抗体检测亦具有较高的敏感性和特异性。