多肽纳米探针(新纳米探针助力研究)

2006 年，《国家中长期科学和技术发展规划纲要》将蛋白质科学列为重大科学研究计划之首（另外三个是纳米科学、量子调控、生殖与发育）。

同时，为了更好地促进中国蛋白质科学的发展、以及和全球学界的交流，中国成立了蛋白质学会。南京大学生命科学学院李根喜教授，成为学会委员、并担任副秘书长。

2011 年换届，其担任副主任兼秘书长（现任秘书长是邵峰院士；主任是施一公院士）。

这让李根喜有机会与蛋白质科学各领域的专家进行深入交流，也让他得以较早开展蛋白质定量新方法研究，并率先提出基于多肽研制生物传感器，借此发展出蛋白质分析的新方法。

在经典的蛋白质分析中，一般要利用抗体来识别靶标蛋白。但是，进一步提高蛋白质定量分析的灵敏度、选择性和准确性，则不可避免地牵扯到位点特异性共价衍生，甚至是密码子拓展等较为复杂的蛋白质工程技术。

为了寻找高效低成本的蛋白质分子识别与传感技术，学界曾尝试把核酸等结构更简单、更易于人工合成的靶向结合配体，来用于蛋白质定量的研究。

另一方面，由于抗体免疫反应的化学本质，在于少数可变区多肽与靶蛋白的特异性接触。同时，被解析出来的蛋白质结构逐渐增多，越来越多的蛋白质与其配体相互作用的机制也被研究清楚。

十多年来，李根喜实验室一直尝试利用多肽作为传感器的骨架，借助多肽的天然识别能力和独特的自组装行为，构建了多种基于多肽的电化学生物传感界面，并将其应用于癌症等重大疾病蛋白质标志物的灵敏检测分析。

近日，该团队提出一种赋予多肽电活性的策略，在无需额外标记的前提下，可让多肽兼具靶标识别和信号转导的功能。在重大疾病诊断及药物筛选等领域，这一传感策略具备应用潜力。

通过替换多肽的蛋白识别序列，可建立具有广泛靶标使用范围的蛋白质电化学生物传感方法。因此，对于其他生物传感器的设计和应用，该成果也可带来一定借鉴作用。

发展基于多肽纳米结构的新型传感器

近些年来，生物样本中的蛋白质分析以及活性检测，为研究蛋白质功能调控、探寻蛋白质功能的结构基础，提供了重要手段和技术路径。

不仅如此，在生物医学的应用上，对于攻克癌症、心血管疾病、糖尿病等攸关人类健康的重大生物医学难题，针对临床样本进行蛋白质分析，也将起到重要推动作用。

作为各类代谢和调控等生命功能的主要承载者，蛋白质的表达与活化随时都会受到细胞信号转导网络的严密调控。在疾病等非正常状态下，蛋白质表达与活化水平的高低，与疾病的发生发展存在直接相关性。

目前，凭借大量的临床案例积累，学界已建立了大批疾病特异性的标志蛋白。可以说，针对疾病相关的标志性蛋白进行定量分析，已成为疾病筛查与诊断、分期分级及预后的重要手段和依据。

因此，亟需发展出一种操作简单、响应敏捷、且价格低廉的蛋白质分析新方法。在生命科学研究和医疗诊断中，生物传感器是最常用的器件。有效的生物传感，离不开对于靶标的特异性识别、以及由靶标引起的信号改变。

如今，作为蛋白质分析的一种强有力工具，多肽也被作为识别元件使用，并已广泛用于电化学生物传感器的构建。然而，对于大部分分子识别事件，多肽仍然较难产生可以直接测得的信号。

因此，在以往的传感策略中，多肽一般需要和电化学信号标签，比如二茂铁、亚甲基蓝等进行共价连接，这无疑增加了传感成本。

而且，这类传感器通常采取“一对一”策略，即一个靶标结合事件对应一个信号输出的模式，这根本无法满足对于低丰度蛋白的定量检测。

近期有研究表明，多肽可通过氢键、疏水作用、静电相互作用、范德华力等非共价作用，来形成特定的纳米结构，比如颗粒、纤维、二维片层等，这让其有潜力作为信号分子支架，来对信号进行放大和输出。

基于上述背景，并结合课题组已有积淀，该团队提出一种将多肽的蛋白识别能力、和电信号放大输出过程联系起来的新策略。

具体而言，其设计出一种功能性两亲肽单体，一端含有多个疏水性芳香族氨基酸，一端为相对亲水的靶向序列，能与肿瘤细胞表面高表达的整联蛋白特异性识别与结合。

这一多肽序列无需任何额外修饰，因此电活性分子二茂铁甲酸能与其通过非共价相互作用，从而以自发共组装的形式，形成具有电活性的多肽纳米探针（ePNPs，electroactive peptide nanoprobes）。

期间，李根喜和团队还利用电活性多肽纳米探针，在电极传感界面构建出“三明治”结构，通过对细胞表面蛋白的特异识别，实现了对肿瘤细胞的电化学检测分析。

图 | 基于电活性多肽纳米探针（ePNPs）构建细胞传感器原理（来源：Biosens. Bioelectron）

以三阴性乳腺癌细胞 MDA-MB-231 为例，传感器峰值电流与细胞浓度之间，呈现出良好的线性关系，故可用于细胞的定量分析。实验结果还表明，该传感器具有较高的选择性，可将 MDA-MB-231 细胞与其他细胞区分开。

即使是在稍微复杂的测试环境、比如含有 10% 的胎牛血清中，也表现出良好的传感性能。为进一步证实电活性多肽纳米探针的通用性，课题组还对肝癌细胞 HepG2 进行了检测分析，结果同样得到了满意的实验结果。

总的来说，本工作构建的基于电活性多肽纳米探针的传感器新颖之处在于：

①利用两亲性多肽和电活性分子的共组装，获得了电活性多肽纳米探针。②上述探针能同时实现靶标识别和信号转导。③基于该探针构建的细胞传感器，可实现对不同肿瘤细胞的简单且灵敏的分析。

近日，相关论文以《基于电活性肽纳米探针的肿瘤细胞电化学生物传感器的研究》（An electrochemical biosensor based on electroactive peptide nanoprobes for the sensitive analysis of tumor cells）为题，发表在Biosensors and Bioelectronics（IF 12.5）上。曾余静担任第一作者，合肥工业大学食品与生物工程学院副教授李超和李根喜担任共同通讯作者[1]。

其中一位审稿人认为，“该多肽探针合成简单，构建的传感器分析性能良好，且具有一定的普适性，对今后发展基于多肽纳米结构的新型传感器具有重要意义。”

将构建具有临床适用性的生物传感器

如前所述，作为最早系统性地借助多肽，来研制生物传感器的实验室之一，该团队在领域内已有一定积累。

为了利用多肽的生物化学多样性，以便提出新的传感技术，同时聚焦生物医学检验。

通过阅读文献，他们提出了这样的问题和假设：为了避免化学标记，能否将多肽的识别和信号比如电信号、荧光信号、比色信号的产生直接联系起来？随后该团队调研大量文献，在多肽自组装形成的纳米结构上，有了如下两个发现：一方面其能保留对蛋白的识别能力；另一方面它可作为载体负载各类小分子。

理论支持已经到位，接下来便是设计方案和开展预实验。课题组将多肽设计成比较简单的两亲肽，并尝试与不同信号分子共组装。

详细来说，他们先对多肽本身的自组装行为进行探究和表征，然后与不同的电信号分子、染料分子等进行共组装，借此筛选出最佳的信号分子，以便确定后续的传感模式。

接着，开始对传感器进行初测，以检验方案的可行性。然后是方案完善。在这一阶段，课题组对于影响传感器分析性能的几个关键实验条件予以优化。在最优条件下，他们将传感器用于靶标的定量分析，并评估了传感器的分析性能譬如灵敏度、选择性、抗干扰能力等。

当然，研究过程也并非一路顺风。李根喜表示，实验初期他们发现合成的电活性多肽探针并不稳定，这让后期实验非常麻烦。

期间，他多次开导学生不要灰心，提醒大家全面考虑各种因素、统筹性地解决问题。通过查找文献和数次摸索，其发现多肽与小分子的相互作用，会受到溶液离子强度、以及 pH 等条件的影响。

此次论文的第一作者曾余静，是课题组的博士研究生。她也是南京大学 2019 级“名师计划”入选者。要想招聘“名师计划”中的学生，对于教师自身经验也有一定要求。

所以，作为老师能招募到曾余静这样的优秀学生，也并非一件易事。李根喜说：“我曾培养了樊春海（2019 年当选中国科学院院士）、张文君（2021 年获得美国国家青年科学家奖）等许多学生，因此具有招收‘名师计划’学生的资格。

另一方面，该计划要求学生品学兼优，基础好而且有上进心，各方面都很优秀才可以入选。基于此，“曾余静于 2019 年入选‘名师计划’。”

此外，李根喜以前的一位学生、目前在合肥工业大学（下称“合工大”）任教的李超副教授，也对本成果做出了较多贡献。

他本科就读于合工大，考取南京大学的研究生以后，在李根喜实验室先后完成硕博连读和两年博后训练，后面则直接获得合工大的副教授职位。“桃李不言，下自成蹊”，这或许也是李根喜的个人影响力所在。

接下来，李根喜实验室将继续以多肽作为传感骨架，尝试利用自组装肽和人工合成纳米材料之间的相互作用，从而提出与疾病相关的新型蛋白分析方法。同时，也将开展临床合作，构建和优化具有临床适用性的生物传感器。

参考资料：

1. Zeng, Y., Qu, X., Nie, B., Mu, Z., Li, C., & Li, G. (2022). An electrochemical biosensor based on electroactive peptide nanoprobes for the sensitive analysis of tumor cells.Biosensors and Bioelectronics,215, 114564.